2021 年，我国科学家设计了一种下图所示的人造淀粉合成代谢路线（ ASAP ），在高密度氢能的作用下，成功将 CO 2 和 H 2 转化为淀粉。 ASAP 由 11 个核心反应组成，依赖许多不同生物来源的工程重组酶。科学家表示，按照目前的技术参数，在不考虑能量输入的情况下， 1 立方米生物反应器的年淀粉产量，理论上相当于种植 1/3 公顷玉米的淀粉年产量。下列说法正确的是（ ）
A ．该反应器的能量输入需要人工提供高能氢和 ATP
B ．人工合成淀粉同样需要 CO 2 的固定和 C 5 的再生，最终将 C 6 合成淀粉
C ． ASAP 代谢路线可能增加农药、化肥等的施用，对环境造成的负面影响
D ．该项技术走向工业化可以制备出大量工程重组酶
A
【分析】该反应器模光合作用，将 CO 2 和 H 2 转化为淀粉需要人工供酶和能量，同样需要 CO 2 的固定， C 3 的还原。
【详解】 A 、该反应器需要高能氢以及 ATP 还原 C 3 ，故该反应器的能量输入需要人工提供高能氢和 ATP ， A 正确；
B 、人工合成淀粉同样需要 CO 2 的固定，但不需要 C 5 的再生， B 错误；
C 、由题意可知， ASAP 代谢路线有助于减少农药、化肥等的施用，对环境造成的负面影响， C 错误；
D 、该反应器需要酶，大量工程重组酶的制备是该项技术走向工业化最可能面临的难题， D 错误。
故选 A 。
关于物质提取、分离或鉴定的高中生物学相关实验，叙述错误的是（ ）
A ．研磨肝脏以破碎细胞用于获取含过氧化氢酶的粗提液
B ．利用不同物质在氯化钠溶液中溶解性的差异粗提取 DNA
C ．依据层析液中的溶解度不同对光合色素进行纸层析分离
D ．利用与双缩脲试剂发生颜色变化的反应来鉴定蛋白质
B
【分析】 DNA 在不同浓度的 NaCl 溶液中溶解度不同（ 0.14mol/L 溶解度最低），利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使 DNA 充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。
【详解】 A 、肝脏细胞中含有过氧化氢酶，因此研磨肝脏以破碎细胞用于获取含过氧化氢酶的粗提液， A 正确；
B 、 DNA 不溶于酒精，而细胞中的某些蛋白质可溶于酒精，因此利用不同物质在酒精溶液中溶解性的差异粗提 DNA ， B 错误；
C 、依据光合色素在层析液中溶解度的差异对光合色素进行纸层析分离， C 正确；
D 、蛋白质可以与双缩脲试剂发生紫色反应，因此利用与双缩脲试剂发生颜色变化的反应来鉴定蛋白质， D 正确。
故选 B 。
用农杆菌侵染水稻（二倍体）细胞，获得 1 条染色体上 R 基因被插入 T-DNA 的个体 T0 。 T-DNA 插入基因的位置如图 1 所示。 T0 自交得 T1 ，同时用 P1 、 P2 、 P3 为引物检测 T1 个体的基因组成情况，如图 2 所示。（图 1 箭头方向为引物所在子链的延伸方向； R 基因被 T-DNA 插入后，用 P1 、 P2 为引物无法完成 PCR ）。下列叙述 错误 的是（ ）
A ．该实验中所用的 P1 、 P2 、 P3 三种引物均为单链 DNA
B ． R 基因被 T-DNA 插入后导致基因突变，可能无法表达相应蛋白
C ．用 P1 、 P2 引物进行 PCR 得到产物的个体均为 R 基因纯合子
D ．若调查样本量足够大， W 、 H 、 M 个体的比例约为 1 ： 2 ： 1
C
【分析】用农杆菌侵染水稻（二倍体）细胞，获得 1 条染色体上 R 基因被插入 T-DNA 的个体 T0 ， T0 为杂合子，其自交后代理论上为 1∶2∶1 。
【详解】 A 、引物一般为单链 DNA 分子， A 正确；
B 、 R 基因被 T-DNA 插入后， R 基因被破坏，所以无法表达相应蛋白， B 正确；
C 、 R 基因被 T-DNA 插入后，用 P1 、 P2 为引物无法完成 PCR ，用 P1 、 P2 引物进行 PCR 得到产物的个体不可能是 R 基因纯合子， C 错误；
D 、 T0 为杂合子，自交后代理论上为 1∶2∶1 ，图中 W 、 H 、 M 个体的比例不为 1∶2∶1 ，可能是因为调查的样本数量较小，误差较大所致， D 正确。
故选 C 。
酒精是生物学实验中常用的试剂，下列关于酒精的使用方法 不恰当 的是（ ）
A ．绿叶中色素的提取和分离实验中，可以用无水乙醇分离绿叶中的色素
B ．脂肪鉴定实验中，染色后滴加 2 滴体积分数为 50% 的酒精，洗去浮色
C ．制作有丝分裂临时装片时，将酒精与盐酸混合，对组织材料做解离处理
D ． DNA 粗提取与鉴定实验中，用体积分数为 95% 的冷酒精溶液析出 DNA
A
【分析】酒精是生物学实验中常用的试剂，如在细胞中脂肪的观察、有丝分裂实验、土壤中小动物丰富度研究等实验中需要使用。
【详解】 A 、色素易溶于有机溶剂，故绿叶中色素的提取和分离实验中，可以用无水乙醇提取绿叶中的色素，分离色素应用层析液， A 错误；
B 、脂肪鉴定实验中，染色后滴加 2 滴体积分数为 50% 的酒精，洗去浮色， B 正确；
C 、制作有丝分裂临时装片时，将体积分数 95% 的酒精与质量分数 15% 的盐酸混合，对组织材料做解离处理，以使组织细胞分离， C 正确；
D 、 DNA 不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，向滤液中加入冷却的体积分数为 95% 的酒精，静置 2 ～ 3min, 溶液中会出现白色丝状物，就是粗提取的 DNA ， D 正确。
故选 A 。
高温导致葡萄果实溃烂，影响品质和产量。为探究葡萄响应热胁迫的机制，研究者检测 42℃ 处理后葡萄幼苗中 V 基因表达水平，结果如图。以下说法 不正确 的是（ ）
A ． V 基因表达出 V 蛋白的过程需要三种 RNA 参与
B ．提取葡萄的 DNA 进行 PCR 扩增可检测 V 基因表达水平
C ．实验结果表明 V 蛋白与葡萄响应热胁迫的调控过程相关
D ．敲除 V 基因检测葡萄的抗热能力证明 V 蛋白是否参与热胁迫
B
【分析】基因表达包括转录和翻译两个过程，其中转录是以 DNA 的一条链为模板合成 RNA 的过程，该过程主要在细胞核中进行，需要解旋酶和 RNA 聚合酶参与；翻译是以 mRNA 为模板合成蛋白质的过程，该过程发生在核糖体上，需要以氨基酸为原料，还需要酶、能量和 tRNA 。
【详解】 A 、 V 基因表达出 V 蛋白的过程需要 mRNA 、 tRNA 、 rRNA 三种 RNA 参与， A 正确；
B 、 PCR 扩增不可检测 V 基因表达水平， B 错误；
C 、由图可知， 42℃ 处理，后 V 蛋白表达量增大，说明 V 蛋白与葡萄响应热胁迫的调控过程相关， C 正确；
D 、可敲除 V 基因检测葡萄的抗热能力证明 V 蛋白是否参与热胁迫， D 正确。
故选 B 。
SRY 基因为 Y 染色体上的性别决定基因，可用 SRY-PCR 法鉴定胚胎性别，其基本程序如下图。相关说法正确的是（ ）
A ．提取滋养层中的细胞 DNA 作为复制模板
B ．样品中每个 DNA 都含模板 DNA 的两条链
C ．样品 DNA 含有胚胎细胞全部的遗传信息
D ． SRY 探针能与样品中 X 染色体 DNA 杂交
A
【分析】 SRY-PCR 法：胚胎工程中，采集的卵母细胞，都要在体外经人工培养成熟后，才能与获能的精子受精。胚胎植入前遗传学诊断，要在囊胚期，取样滋养层细胞，提取 DNA ，然后常用 SRY-PCR 法进行性别鉴定。也可以培养滋养层细胞，制片观察染色体的形态和数目。
【详解】 A 、滋养层细胞是胎儿发育过程中形成的细胞，将来发育为胎儿的胎膜和胎盘，故其 DNA 可作为复制模板， A 正确；
B 、 DNA 复制的特点是半保留复制，新合成的子一代 DNA 含模板 DNA 的一条链， B 错误；
C 、由于 PCR 扩增过程只用了一个基因引物，所以只能是扩增了部分基因，不能包括细胞全部基因， C 错误；
D 、分析题意， SRY 基因为 Y 染色体上的性别决定基因，故 SRY 探针能与样品中 Y 染色体 DNA 杂交， D 错误。
故选 A 。
PCR 引物的 3' 端为结合模板 DNA 的关键碱基， 5' 端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列叙述正确的是（ ）
A ．该图表示 PCR 循环中的变性环节
B ． PCR 第四次循环要消耗 15 对引物
C ． Taq 酶催化相邻的两个游离 dNTP 之间形成磷酸二酯键
D ．用图中引物扩增两个循环后即可获得添加限制酶切点的产物
D
【分析】 PCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定 DNA 的核酸合成技术。 PCR 需要模板 DNA 、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定 DNA 聚合酶（ Taq 酶）。
【详解】 A 、图中引物与模板链碱基互补配对，该图表示 PCR 循环中的复性环节， A 错误；
B 、 PCR 三次循环共消耗 7 （ 2 3 -1 ）对引物， PCR 四次循环共消耗 15 （ 2 4 -1 ）对引物，第四次循环要消耗 8 对引物， B 错误；
C 、 dNMP 只有一个磷酸基团，为脱氧核苷酸， dNTP 有三个磷酸基团，延伸时，在 Taq 酶催化下， dNMP 作为扩增的原料会依次连接到 3' 端，相邻的 dNMP 间形成磷酸二酯键， C 错误；
D 、由于一个引物不在该片段的端点，因此第一轮循环后，得到的一个 DNA 片段中两条脱氧核苷酸链都不等长，通过绘图可推知，再经过一次循环，产物中开始出现脱氧核苷酸链等长的 DNA 片段，所以扩增两个循环后即可获得添加限制酶切点的产物， D 正确。
故选 D 。
发酵工程在我国食品工业、医药工业及农牧业等许多领域都得到了广泛的应用。下列相关叙述正确的是（ ）
A ．主要利用毛霉水解大豆原料中的蛋白质，经淋洗后可酿制成酱油产品
B ．利用酵母菌等发酵生产的单细胞蛋白属于分泌蛋白，可制成微生物饲料
C ．将病原体的抗原基因转入适当的微生物细胞，可获得用作疫苗的表达产物
D ．利用发酵工程生产的微生物农药防治病虫害属于化学防治
C
【分析】发酵工程是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种技术。
【详解】 A 、以大豆为主要原料，利用产生蛋白酶的霉菌（如黑曲霉），将原料中的蛋白质水解成小分子的肽和氨基酸，然后经淋洗、调制可以制成酱油产品， A 错误；
B 、用酵母菌等生产的单细胞蛋白可作为食品天添加剂，单细胞蛋白指的是酵母菌菌体， B 错误；
C 、可以将乙肝病毒的抗原基因转入酵母菌通过发酵工程制备乙肝疫苗， C 正确；
D 、微生物农药是利用微生物或其代谢物来防治病虫害的，微生物农药是生物防治的重要手段， D 错误。
故选 C
2013 年，张锋首次利用 CRISPR/Cas9 系统对哺乳动物细胞进行了基因组编辑，引起世界的轰动，使用该技术需要向进行编辑的细胞中加入人工合成的作为 “ 向导 ” 的短链 RNA 和一种来自细菌的核酸酶 Cas9 。下列叙述正确的是（ ）
A ．细菌中的核酸酶 Cas9 由细胞内的具膜细胞器核糖体合成
B ．基因组编辑技术已取得成功，可以根据自身需求随意 “ 改造 ” 基因
C ．短链 RNA 与目的基因的 DNA 序列结合时，会出现 A 与 T 的配对
D ．该哺乳动物成熟的红细胞以 DNA 的两条链为模板合成子代 DNA
C
【分析】基因工程的三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、 DNA 连接酶、运载体。
【详解】 A 、细菌中的核酸酶 Cas9 由核糖体合成，但核糖体不具有膜结构， A 错误；
B 、基因编辑技术可对基因进行定点编辑，不能随意改造基因， B 错误；
C 、短链 RNA 与目的基因的 DNA 序列结合时， RNA 中的 A 可与 DNA 中的 T 进行配对， C 正确；
D 、哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核和任何细胞器，不能进行 DNA 的复制， D 错误。
故选 C 。
科学家拟培育转人溶菌酶基因山羊以大规模生产人溶菌酶（从乳汁中提取），部分过程如图所示。质粒 S 中的标记基因 Leu 控制合成亮氨酸，标记基因 GFP 控制合成绿色荧光蛋白；四种限制酶的识别序列及切位点见下表。
| 限制酶 | BamHⅠ | BglⅡ | HindⅢ | XbaⅠ |
| 识别字列和切割位点 | G↓GATCC | A↓GATCT | A↓AGCTT | T↓CTAGA |
依据题目信息，下列能成功筛选出含重组质粒 T 的成纤维细胞的说法是（ ） A ．培养基中不加亮氨酸，培养一段时间后观察，细胞不显示出绿色荧光
B ．培养基中加入亮氨酸，培养一段时间后观察，细胞不显示出绿色荧光
C ．培养基中加入亮氨酸，培养一段时间后观察，细胞显示出绿色荧光
D ．培养基中不加亮氨酸，培养一段时间后观察，细胞显示出绿色荧光
A
【分析】基因工程技术的基本步骤：（ 1 ）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用 PCR 技术扩增和人工合成。（ 2 ）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（ 3 ）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（ 4 ）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测： ① 检测转基因生物染色体的 DNA 是否插入目的基因 --DNA 分子杂交技术； ② 检测目的基因是否转录出了 mRNA-- 分子杂交技术； ③ 检测目的基因是否翻译成蛋白质 -- 抗原 - 抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】用限制酶 BamHⅠ 、 HindⅢ 切割质粒 S 和目的基因，形成的重组质粒 T 含有标记基因 Leu 和 GFP 基因，但 BamHⅠ 将 GFP 基因切割开，使得该基因失去遗传效应，而标记基因 Leu 控制合成亮氨酸。故培养基中不加亮氨酸，培养一段时间后观察，细胞不显示出绿色荧光的成纤维细胞是含有重组质粒 T 的细胞， BCD 错误， A 正确。
故选 A 。
DNA 遇 ______ （沸水浴）会染成 ______ 色，因此， ______ 可以作为鉴定 DNA 的试剂。
二苯胺 蓝 二苯胺
【详解】在沸水浴的条件下， DNA 遇二苯胺会变蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定 DNA 的试剂。
在析出杂质较少的 DNA 时，应向滤液中加入与滤液体积相等的 ______ 静置 2 ～ 3min ，溶液中会出现 ______ ，这是粗提取的 DNA 。
冷却的酒精溶液 白色丝状物
【分析】 DNA 粗提取：利用 DNA 与 RNA 、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取 DNA ，去除其他成分。 DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度的 NaCl 溶液中溶解度不同，选择适当的盐浓度能使 DNA 充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。大多数蛋白质不能忍受 60~80℃ 的高温，而 DNA 在 80℃ 以上才会变性。
【详解】将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的酒精溶液，静置，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的 DNA 。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物。
基因的 “ 剪刀 ” 指的是 ________ ；目前常用的运载体有 _______________________________________ 。
限制性核酸内切酶 质粒 、噬菌体和动植物病毒等
【详解】基因工程中，需基因 " 剪刀 ” 、基因运载体、基因 " 针线 " 三种工具，基因的 “ 剪刀 ” 指的是限制性核酸内切酶；目前常用的运载体有质粒 、噬菌体和动植物病毒等。
DNA 基因工程至少需要三种工具： “ 分子手术刀 ”——______________ （又叫 _________ ）； “ 分子缝合针 ”——___________ ； “ 分子运输车 ”—— 基因进入受体细胞的 _________ 。
（ 1 ） “ 分子手术刀 ”
① 来源：主要是从 _________ 中分离纯化出来的。
② 功能：能识别双链 DNA 分子的某种 _____ 的核苷酸序列，且使每一条链中 _____ 部位的两个核苷酸之间的 ____________ 断开，因此具有 ______ 性。
③ 结果：经限制酶切割产生的 DNA 片段末端通常有两种形式： ___________ 和 __________ 。
（ 2 ） “ 分子缝合针 ”——_______________
① 两种 DNA 连接酶（ E·coliDNA 连接酶和 T 4 DNA 连接酶）的比较：
a. 相同点：都缝合 __________________ 。
b. 区别： E·coli DNA 连接酶来源于 ______________ ，只能将双链 DNA 片段互补的 _______ 之间的 ___________ 键连接起来；而 T 4 DNA 连接酶能缝合 ________ ，但连接平末端的之间的效率较 ___ 。
② 与 DNA 聚合酶作用的异同： DNA 聚合酶只能将 _________ 加到已有的核苷酸片段的末端，形成 _________ 。 DNA 连接酶是连接 _______________ 的末端，形成 _____________ 。
（ 3 ） “ 分子缝合针 ”
① 作用： 将双链 DNA 片段 “ 缝合 ” 起来， 恢复被 ________ 切开的两个核苷酸之间的 __________________ 。
② 种类：
| 种类 | 来源 | 特点 |
| E.coliDNA 连接酶 | ___________ | 只能 “ 缝合 ” 具有 _________ 的双链 DNA 片段 |
| T 4 DNA 连接酶 | __________ | 既可以 “ 缝合 ” 双链 DNA 片段 ____________ ，又可 “ 缝合 ” 双链 DNA 片段的 _________ 。 |
（ 4 ） “ 分子运输车 ”
① 载体具备的条件：
a. 能在受体细胞中 _______ 并 ___________ 。
b. 具有 __________________ ，供外源 DNA 片段插入。
c. 具 有 ___________ ，供重组 DNA 的 ______ 和 _______ 。
② 最常用的载体是 _______ ，它是一种裸露的、结构简单的、独立于 ______________ ，并具有 ___________ 的双链 _______DNA 分子。
③ 其它载体： _____________________ 、 ___________ 。
限制性核酸内切酶 限制酶 DNA 连接酶 载体 原核生物 特定 特定 磷酸二酯键 专一 黏性末端 平末端 DNA 连接酶 磷酸二酯键 T4 噬菌体 黏性末端 磷酸二酯 两种末端 低 单个核苷酸 磷酸二酯键 两个 DNA 片段 磷酸二酯键 限制酶 磷酸二酯键 T4 噬菌体 原核生物 互补黏性末端 互补黏性末端 平末端 复制 稳定保存 一至多个限制酶切点 标记基因 鉴定 选择 质粒 细菌染色体之外 自我复制能力 环状 噬菌体的衍生物 动植物病毒
【解析】略
蛋白质工程的基本原理：
（ 1 ）它可以根据 ______________________________________ ，又称为第二代的基因工程。
（ 2 ）基本途径：从预期的 ___________ 出发，设计预期的 _________ ，推测 ________________ ，找到相对应的 __________________( ) 。下图中是蛋白质工程的顺序的是 ________________________________ ；
（ 3 ）设计中的困难：如何推测 ___________ 以及 ______________________ 。
人的需求来设计蛋白质的结构 蛋白质功能 蛋白质结构 应有的氨基酸序列 脱氧核苷酸序列 基因 E 、 F 、 G 、 A 、 B 、 C 、 D 非编码区 内含子的脱氧核苷酸序列
【解析】略
蛋白质工程的应用
（ 1 ） 医药工业方面：
① 速效 _________________ ： 改变氨基酸序列， 抑制胰岛素的聚合。
②___________ ：一个 ___________ 替换为 ___________ ， 延长保存时间。
③___________ ：将小鼠 ______ 上结合抗原的区域 “ 嫁接 ” 到人的 ______ 上， 降低 ______________________ 。
（ 2 ）其他工业方面： 广泛用于改进酶的性能或开发新的工业用酶。 如 ______________ 。
（ 3 ）农业方面：
① 改造某些参与调控光合作用的 ______ ， ______ 植物光合作用的效率。
② 改造微生物蛋白质的 ______ ， 增强防治病虫害的效果。
胰岛素类似物 干扰素 半胱氨酸 丝氨酸 单克隆抗体 抗体 抗体 诱发免疫反应的强度 枯草杆菌蛋白酶 酶 提高 结构
【解析】略
蛋白质工程崛起的缘由
（ 1 ）基因工程的实质和不足：
① 实质： __________________________________________ 。
② 基因工程存在的不足： _____________________________________ 。
（ 2 ） 蛋白质工程的崛起：
① 理论和技术条件：分子生物学、 晶体学以及计算机技术的迅猛发展。
② 天然蛋白质存在不足：天然蛋白质的 ______________________ ， 却 _________ 完全符合人类生产和生活的需要。
③ 实例：
| 蛋白质缺陷 | 改造措施 | 改造后果 |
| 玉米中赖氨酸 含量 ________ | _______________ | 叶片和种子中游离的赖氨酸分别 提高 ___ 倍和 ___ 倍 |
将一种生物的基因转移到另一种生物体内 , 后者可以产生它本不能产生的蛋白质 , 进而表现出新的性状 原则上只能生产自然界已存在的蛋白质 结构和功能符合特定物种生存的需要 不一定 低 赖氨酸合成中两种酶的氨基酸背替换 5 2
【解析】略
有关蛋白质工程的两点提醒：
（ 1 ） 改造对象是基因：任何一种天然蛋白质都是由 __________ 的， 改造了 ______ 即对蛋白质进行了改造， 而且改造过的蛋白质可以遗传下去。
（ 2 ） 基因突变的新基因中含有不编码蛋白质的序列， 而蛋白质工程中的 ______ 则没有。
（ 3 ） _________________________
基 因编码 基因 新基因 
【解析】略
基因工程在医药卫生领域的应用
（ 1 ） _____________ ：
① 常见的药物： _________ 、 ______ 、 ______ 和 ______ 等。 我国生产的 ________ 、 血小板生成素、 促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子等基因工程药物均已投放市场。
② 批量生产药物：乳腺（房） 生物反应器。
a. 目的基因： _______________ 。
b. 启动子： ____________________________________ 。
c. 受体细胞： ________ 。
（ 2 ）移植器官： 在器官供体的基因组中导入某种 __________ ， 以抑制抗原决定 __________ ， 或 _____________________ ， 培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。
（ 3 ）培养乳腺生物反应器转基因动物时为什么要选用乳腺中特异性表达的基因的启动子？
______________________________________________________________ 。
生产药物 细胞因子 抗体 疫苗 激素 重组人干扰素 药用蛋白基因 乳腺中特异性表达的基因的启动子 受精卵 调节因子 基因的表达 设法除去抗原决定基因 乳腺生物反应器通过分泌的乳汁提取相应的基因表达的产品 , 乳腺中特异性表达的启动子可让目的基因在乳腺细胞中表达
【解析】略
蛋白质工程的概念：
蛋白质工程是指 _______________________________________________________ 。
基因工程在原则上只能生产 _______________ 的蛋白质。
以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求 自然界已存在
【解析】略
蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构 ( )
错误
【详解】蛋白质工程指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求，蛋白质工程的直接操作对象是基因。
故错误。
蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质 ( )
正确
【详解】蛋白质工程师指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。故说法正确。
由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用 ( )
错误
【详解】大肠杆菌细胞中缺少内质网、高尔基体等细胞器，获得人的干扰素后要经过进一步的修饰才具有生物活性。
错误。
利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中 ( )
错误
【分析】动物乳腺生物反应器是基于转基因技术平台，使外源基因导入动物基因组中并定位表达于动物乳腺，利用动物乳腺天然、高效合成并分泌蛋白的能力，在动物的乳汁中生产一些具有重要价值产品的转基因动物的总称。
【详解】利用乳腺生物反应器生产医药产品，如人的血清白蛋白，需将人的血清白蛋白基因导入了动物的受精卵中。
故错误。
E ． coli DNA 连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端 ( )
错误
【详解】 E.coliDNA 连接酶只能连接黏性末端，故错误。
耳是脊椎动物的感官之一，负责感受声音和维持躯体的平衡。研究者利用 Tol2 （特定 DNA 片段，可随机插入到染色体基因组任意位点）获得斑马鱼突变体。
(1) 研究者用显微注射法将 Tol2 导入斑马鱼的 ______ 中，得到杂合体斑马鱼（ F 0 ）。 Tol2 的随机插入使每一条 F 0 斑马鱼突变位点都不相同。为获得纯合突变体，需将每一条 F 0 ______ 。用上述方法获得的 G 突变体，只有突变基因纯合时表现为耳石减小、不能保持躯体平衡，说明该插入突变为 ______ 性突变。
(2) 已报道的 M 突变体与 G 突变体性状一样。研究人员为探究 M 突变体与 G 突变体是否为同一基因突变导致，进行下图所示实验：
实验结果表明： __________________ ，且 ____________ 。
(3) 为探究 G 基因和 M 基因对内耳发育的调控机制，研究人员进行如下实验。
实验一：将体外合成的斑马鱼 M 基因的 mRNA 注射到 G 突变体中
实验二：将体外合成的斑马鱼 G 基因的 mRNA 注射到 M 突变体中
若实验结果为 ______ ，则说明 G 基因通过调控 M 基因的表达来调控内耳的发育。
(4)G 蛋白是转录因子，能结合在核苷酸序列 “——AACCGGTT——” 上，启动基因的转录。序列分析发现， M 基因启动子含上述结合序列，由此推测 ____________ 。为验证这一假说，设计如下方案：
对照组：将野生型 M 基因的启动子与绿色荧光蛋白（ GFP ）基因连接，构建基因表达载体，导入野生型斑马鱼，观察绿色荧光蛋白在内耳中的表达情况；
实验组：将 ______ 与绿色荧光蛋白（ GFP ）基因连接，构建基因表达载体，导入野生型斑马鱼，观察绿色荧光蛋白在内耳中的表达情况。
(1) 受精卵 与野生型杂交得到 F 1 ，再让 F 1 随机交配 ( 或 F 1 与 F 0 回交 ) 得到 F 2 ， F2 中即可出现突变基因的纯合子
隐
(2) M 突变体与 G 突变体不是同一基因突变导致 M 基因与 G 基因位于非同源染色体上
(3) 实验一的斑马鱼恢复正常，实验二的斑马鱼仍表现为耳石减小、不能保持躯体平衡
(4) G 蛋白可能通过结合 M 基因的核苷酸序列 “—AACCGGTT—” 调控 M 基因的转录 核苷酸序列 “—AACCGGTT—” 突变的 M 基因的启动子
【分析】由题意可知 F 2 中正常表现型 ∶ 躯体平衡失调 =9∶7 ，是 9∶3∶3∶1 的变式，所以可据此推断这两对基因位于两对同源染色体上，遵循基因自由组合定律。
（ 1 ）
将目的基因导入动物细胞，常用的方法是：用显微注射技术将目的基因导入动物的受精卵内。 Tol2 的随机插入使每一条 F 0 斑马鱼突变位点都不相同，且每一条 F 0 斑马鱼都是杂合子，为获得纯合突变体，需将每一条 F 0 与野生型杂交得到 F 1 ，以获得更多的杂合子，再让 F 1 随机交配 ( 或 F 1 与 F 0 回交 ) 得到 F 2 ， F 2 中即可出现突变基因的纯合子。用上述方法获得的 G 突变体，只有突变基因纯合时表现为耳石减小、不能保持躯体平衡，若该插入突变为显性突变，则突变基因纯合和杂合时均表现为耳石减小、不能保持躯体平衡，与题意不符，说明该插入突变为隐性突变。
（ 2 ）
根据 F 2 中正常表现型 ∶ 躯体平衡失调 =9∶7 ，是 9∶3∶3∶1 的变式，可知两对基因遵循自由组合定律，即两对基因位于两对同源染色体上，由此可判断 M 突变体与 G 突变体不是同一基因突变导致。
（ 3 ）
结合（ 2 ）小问可知，若表现正常，则需要两对基因均为显性性状， M 突变体中不能形成 M 基因表达的产物， G 突变体中不能形成 G 基因表达的产物，故 M 突变体和 G 突变体均表现为躯体平衡失调。若 G 基因通过调控 M 基因的表达来调控内耳的发育，则实验一将体外合成的斑马鱼 M 基因的 mRNA 注射到 G 突变体中，可翻译形成 M 基因的蛋白，则斑马鱼应恢复正常；而实验二将体外合成的斑马鱼 G 基因的 mRNA 注射到 M 突变体中，由于 M 基因突变体不能转录形成 M 基因的 mRNA ，则斑马鱼仍表现为耳石减小、不能保持躯体平衡。
（ 4 ）
由题意已知， G 蛋白能结合在核苷酸序列 “ 一 AACCGGTT 一 ” 上，启动基因的转录，而 M 基因启动子含上述结合序列，据此可推测 G 蛋白可能通过结合 M 基因的核苷酸序列 “ 一 AACCGGTT 一 " 调控 M 基因的转录。为了验证这一说法， 可将绿色荧光蛋白基因分别与野生型 M 基因的启动子、核苷酸序列 “ 一 AACCGGTT 一 " 突变的 M 基因的启动子分别构建基因表达载体，并导入野生型斑马鱼，观察绿色荧光蛋白在内耳中的表达情况，该实验的自变量为 M 基因的启动子中核苷酸序列 “ 一 AACCGGTT 一 " 是否突变，故实验组应为：将核苷酸序列 “ 一 AACCGGTT 一 " 突变的 M 基因的启动子与绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因连接，构建基因表达载体，导入野生型斑马鱼，观察绿色荧光蛋白在内耳中的表达情况。
环境中常检出残留的四环素类抗生素，科学家采用基因工程技术构建出一种能高效降解四环素的基因工程菌，如图所示。将四环素降解酶基因 tetX 经过 PCR 扩增后，与经过酶切的质粒 pET28a 融合，构建重组质粒并导入大肠杆菌 BL21 ，筛选后得到工程菌 ETD-1 ， ETD-1 可通过发酵工程大量生产四环素降解酶并应用于生产实践。 SapI 、 HindⅢ 、 BamHI 、 NdeI 是几种不同的限制酶。回答下列问题：
(1) 利用 PCR 技术扩增 tetX 基因需要设计引物，引物的作用是 ________________ ；若扩增 n 次，需要的引物数量至少是 ________ 。
(2) 图中 pET28a 的启动子和终止子的作用分别是 ________________________ 。
(3) 为了将 tetX 基因准确地整合到质粒的插入位点，在对 tetX 基因进行扩增时，需在 A 、 B 两端引入限制酶 ________ 的识别序列，原因是 ________________________ 。
(4) 将重组质粒导入大肠杆菌之前，需要用一定浓度的 Ca 2+ 处理大肠杆菌 BL21 ，使细胞处于 ________ 。筛选工程菌 ETD-1 的培养基中需加入的抗生素是 ________ 。
(1) 使耐高温 DNA 聚合酶能够从引物的 3' 端开始连接脱氧核苷酸 2 n+1 － 2
(2)RNA 聚合酶的识别和结合位点，驱动 tetX 基因的转录、使转录在需要的地方停下来
(3) BamHI 、 NdeI 在 tetX 基因的两端引入的这两种酶酶切位点不会破坏 tetX 基因本身的碱基序列，同时引入这两种酶酶切位点可以使 tetX 基因定向插入启动子和终止子之间
(4) 感受态 卡那霉素
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与表达。
（ 1 ）
PCR 技术的原理是 DNA 双链复制，为半保留复制，利用 PCR 技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成一对引物，其引物的作用是使 DNA 聚合酶能从引物的 3' 端开始连接脱氧核苷酸。 DNA 复制为半保留复制，每形成一个子链都需要一个引物，一个目的基因在 PCR 仪中经过 n 次循环，形成了 2 n 个基因， DNA 链为 2 n+1 条，除两条亲代模板链，其它链均为新合成的子链，因此需要消耗 2 n+1 － 2 个引物。
（ 2 ）
图中 pET28a 的启动子是启动转录，因此是 RNA 聚合酶的识别和结合位点，驱动 tetX 基因的转录；终止子的作用是使转录在需要的地方停下来。
（ 3 ）
为了将 tetX 基因准确地整合到质粒的插入位点，在对 tetX 基因进行扩增时，需在 A 、 B 两端引入限制酶 BamHI 、 NdeI 的识别序列。在 tetX 基因的两端引入的这两种酶酶切位点不会破坏 tetX 基因本身的碱基序列，同时引入这两种酶酶切位点可以使 tetX 基因定向插入启动子和终止子之间。
（ 4 ）
一定浓度的 Ca 2+ 处理大肠杆菌 BL21 ，使细胞处于感受态，使重组质粒更容易进入。重组质粒上的卡那霉素抗性基因是完好的，因此可以在筛选工程菌 ETD-1 的培养基中需加入卡那霉素以便筛选。
近年来，生物柴油作为新型能源已经成为世界上应用最广泛、发展迅猛的可再生能源之一。研究人员利用基因工程的方法将油料作物紫苏 DGAT1 基因导入四尾栅藻（操作过程如下图），获得转基因的产油微藻，并利用地热废水培养，不仅能生产生物柴油，还能治理地热废水。请回答：
注： LacZ 基因可使细菌利用加入培养基的物质 X ﹣ gal ，从而使菌落显现出蓝色。若无该基因或该基因被破坏，则菌落成白色。
(1) 将经过处理的连接产物导入到经 CaCl 2 处理后的处于感受态的大肠杆菌细胞，并接种到添加 ____________ 的培养基上培养，一段时间后，挑选颜色为 __________ 的菌落用液体培养基培养，提取质粒 pMD19-DGAT1 。
(2) 用限制酶酶切 pMD19-DGAT1 获得 DGAT1 基因，并与酶切后的载体 pBI121 连接得到 __________ ，并导入到四尾栅藻。 DGAT1 基因序列两端无限制酶酶切位点，由上表中信息推测扩增 DGAT1 基因时所用一对引物的一端分别加上的限制酶识别序列是 _____________________ 。
(3) 用 DGAT1 基因的探针可检测转基因四尾栅藻细胞中的 _______________ 。
(4) 研究人员利用地热废水培养转基因四尾栅藻并检测其油脂含量，结果如下图。结果显示： __________________________________ 。
(5) 为检测转基因四尾栅藻对地热废水的去污能力，研究人员设计实验并得到相应实验结果如下表。
| 指标 | 总氮（ mg/L ） | 总磷（ mg/L ） | 氟化物（ mg/L ） |
| 废水培养基 | 23.2 | 4.32 | 4.56 |
| 培养转基因四尾栅藻 11 天后 | 1.9 | 0.45 | 0.84 |
该实验不能说明转 DGAT1 基因显著提高了四尾栅藻的去污能力。请进一步完善实验设计： ________________ 。
(1) 氨苄青霉素和 X-gal 白色
(2) 基因表达载体 5’-GGATCC-3’ 和 5’-TCTAGA-3’
(3)DGAT1 基因、 mRNA
(4) 转 DGAT1 基因的四尾栅藻油脂含量显著高于非转基因组
(5) 应添加对照组，废水培养非转基因四尾栅藻 11 天后，检测总氮、总磷和氟化物的含量
【分析】据图分析：图中首先提取紫苏细胞的总 RNA 经逆转录得到的 cDNA ，再获得 DGAT1 基因，再将 DGAT1 基因与克隆质粒 pMD19 结合，形成重组质粒，然后将其导入到经 CaCl 2 处理后的处于感受态的大肠杆菌细胞，并接种到添加氨苄青霉素和 X-gal 的培养基培养、筛选。
（ 1 ）
LacZ 基因可使细菌利用加入培养基的物质 X ﹣ gal ，从而使菌落显现出蓝色。若无该基因或该基因被破坏，则菌落成白色。将经过处理的连接产物导入到经 CaCl 2 处理后的处于感受态的大肠杆菌细胞，并接种到添加氨苄青霉素和 X-gal 的培养基培养、筛选，由于重组质粒中没有 LacZ 基因，故挑选颜色为白色的菌落用液体培养基培养，提取质粒 pMD19-DGAT1 。
（ 2 ）
用限制酶酶切 pMD19-DGAT1 获得 DGAT1 基因，并与酶切后的载体 pBI121 连接得到重组表达载体，并导入到四尾栅藻，由于 DGAT1 基因序列两端无限制酶酶切位点，故只能用限制酶切割质粒，根据质粒中含有的限制酶切位点可知，应选择 BamHⅠ 和 XbaⅠ 两种限制酶切割，扩增 DGAT1 基因时所用一对引物的一端分别加上的限制酶识别序列应为 5’-GGATCC-3’ 和 5’-TCTAGA-3’ 。
（ 3 ）
以 DGAT1 基因为探针对可以进行 DNA 分子杂交或分子杂交技术，故用 DGAT1 基因的探针可检测转基因四尾栅藻细胞中的 DGAT1 基因或 mRNA
（ 4 ）
分析该图，结果显示：转 DGAT1 基因的四尾栅藻油脂含量显著高于非转基因组。
（ 5 ）
实验设计应遵循对照原则、单一变量原则等，要证明转 DGAT1 基因显著提高了四尾栅藻的去污能力，进一步完善实验，应添加对照组：废水培养非转基因四尾栅藻 11 天后，检测总氮、总磷和氟化物的含量。
三氯生是一种抑菌物质，具有优异的贮存稳定性，可以替代抗生素用于基因工程中筛选含目的基因的受体细胞。已知 fabV （从霍乱弧菌中发现的烯脂酰 ACP 还原酶）基因可以使大肠杆菌抵抗三氯生。
(1) 通过 PCR 方法扩增 fabV 基因时，先要根据 _____ 设计两种特异性引物序列，以确保 Taq 酶从引物的 3′ 端延伸 DNA 链，至少需要经过 _____ 次扩增才能获得 8 个双链等长的目的基因。
(2) 基因工程的核心步骤是 _____ ；某科研团队将可以受温度调控的基因插入上述选出的重组质粒中，构建了温度调控表达质粒（如图 2 ）。其中 C 基因在低温下会抑制 P 2 ， R 基因在高温下会抑制 P 1 ， 如果将 lacZ 基因和 GFP （绿色荧蛋白）基因插入图 2 质粒中，使得最后表现为低温下只表达 GFP 蛋白，而高温下只表达 lacZ 蛋白。则 lacZ 基因插在 _____ 之间， GFP 基因的插入位置及注意点是 _____ 。
(3) 若以大肠杆菌为受体细胞，筛选上述插入了 GFP 基因的受体细胞的依据是：大肠杆菌能在含 _____ 的培养基上生长，且 _____ 。
(1) 目的基因（ fabV 基因）两端碱基序列 4
(2) 基因表达载体的构建 P 2 →T 2 插在 P 1 →T 1 之间，且不破坏 C 基因和 R 基因
(3) 三氯生 低温下有绿色荧光，高温下无绿色荧光
【分析】 1 、基因工程技术的基本步骤：
（ 1 ）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用 PCR 技术扩增和人工合成。
（ 2 ）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；
（ 3 ）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（ 4 ）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：
① 检测转基因生物染色体的 DNA 是否插入目的基因 DNA 分子杂交技术；
② 检测目的基因是否转录出了 mRNA- 分子杂交技术；
③ 检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原一抗体杂交技术。
④ 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2 、图 1 中 ①-④ 依次为目的基因的获取、表达载体的构建、目的基因导入受体细胞、目的基因的检测。
（ 1 ）
PCR 是一项在生物体外复制特定 DNA 的核酸合成技术，需要 Taq 酶，但 Taq 酶不能从头开始合成 DNA ，前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物，因此需要根据目的基因 fabV 基因的两端按碱基互补配对原则设计引物。至少需要经过 4 次扩增才能获的 8 个双链等长的目的基因。
（ 2 ）
基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，题干信息显示 C 基因在低温下会抑制 P 2 ， R 基因在高温下会抑制 P 1 ，说明 P 2 启动子在高温下可以启动转录； P 1 启动子在低温下可以启动转录。题目显示高温下只表达 lacz 蛋白，则 lacZ 基因要插在 “ 高温下不被抑制 ” 的启动子的后面，即 P 2 →T 2 之间； GFP 基因要低温下表达，则插入位置要在 P 1 →T 1 之间，且不破坏 C 基因和 R 基因。
（ 3 ）
因为 fabV （从霍乱弧菌中发现的烯脂酰 ACP 还原酶）基因可以使大肠杆菌抵抗三氯生，大肠杆菌能在含三氯生的培养基上生长，说明大肠杆菌插入重组质粒，且依据是低温下有绿色荧光高温下无绿色荧光。
【点睛】本题考查基因工程相关知识点，要求学生熟练掌握基因工程的原理、步骤及相关的目的，形成知识网络，结合题目要求解决相关问题。
解脂芽孢杆菌产多种脂肪酶，后者广泛用于日用化工和食品工业，因此利用生物技术规模化生产脂肪 酶有重要意义。图 1 为解脂芽孢杆菌拟核 DNA 中某分泌型脂肪酶编码基因（ LP ）的定位及所用质粒 DNA 的有关信息，图中 BamH1 、 EcoR1 、 Mbo1 均为限制酶。图 2 为固定化与非固定化脂肪酶的相对酶活性与温 度的关系。
(1) 基于上述信息，该项基因工程的目的基因是 _________ 。为了与质粒 DNA 合理重组，解脂芽孢杆菌拟核 DNA 和质粒 DNA 均应用限制酶 ____________ 切割。
(2) 由上述基因工程改造过的细菌规模化生产并提纯分泌型脂肪酶，需要加入硫酸铵使酶蛋白与其 他杂质分离，这属于酶分离提纯步骤中的 __________________________ 。
(3) 为了便于重复使用，上述制得的脂肪酶往往要固定化。比较图 2 的两条曲线，写出固定化酶 的优势是： ________________________ ；劣势是： ______________________________ 。
(1) 脂肪酶编码基因 EcoRⅠ
(2) 使酶蛋白沉淀
(3) 相比非固定化酶，在 0-70℃ 的条件下，固定化酶具有更好的热稳定性，能 在更高与更广的温度范围内保持较高的相对活性 相比非固定化酶，在 0-70℃ 的条件下，固定化酶的最大相对酶活性有所损失， 略低于非固定化酶
【分析】固定化酶技术是用物理或化学手段．将游离酶封锁住固体材料或限制在一定区域内进行活跃的、特有的催化作用，并可回收长时间使用的一种技术。
（ 1 ）
根据题中及图中信息可知，该项基因工程的目的基因是某分泌型脂肪酶编码基因（或 LP ）；含有目的基因的外源 DNA 分子中含有限制酶 BamHl 、 EcoRl 、 Mbol 的识别序列和切割位点，但质粒中不含限制酶 Mbol 的识别序列，因此不能用该酶切割；若用限制酶 BamHl 切割会将质粒上的标记基因都破坏，因此不能用该酶切割。综合以上可知，为了与质粒 DNA 合理重组，解脂芽孢杆菌拟核 DNA 和质粒 DN^ 均应用限制酶 ECORI 切割。
（ 2 ）
由上述基因工程改造过的细菌规模化生产并提纯分泌型脂肪酶，需要加入硫酸铵使酶蛋白与其他杂质分离，这属于酶分离提纯步骤中的沉淀。
（ 3 ）
比较图 2 的两条曲线可知，固定化酶的优势是：固定化酶的活性随温度升高而升高，在 45-60°C 时酶的固定化活性最高；劣势是：在 30-40°C ，固定化酶的活性比非固定化酶活性低。
以我国科学家为主的科研团队将 OSNL （即 4 个基因 Oct4/Sox2/Nanog/Lin28A 的缩写）导入黑羽鸡胚成纤维细胞（ CEFs ），诱导其重编程为诱导多能干细胞（ iPS ），再诱导 iPS 分化为诱导原始生殖细胞（ iPGCs ），然后将 iPGCs 注射到孵化 2.5 天的白羽鸡胚血管中，最终获得具有黑羽鸡遗传特性的后代，实验流程如图。回答下列问题。
(1)CEFs 是从孵化 9 天的黑羽鸡胚中分离获得的，为了获得单细胞悬液，鸡胚组织剪碎后需用 ___________ 处理。动物细胞培养通常需要在合成培养基中添加 ____________________ 等天然成分，以满足细胞对某些细胞因子的需求。
(2) 体外获取 OSNL 的方法有 ________________________ （答出 1 种即可）。若要在 CEFs 中表达外源基因的蛋白，需构建基因表达载体，载体中除含有目的基因和标记基因外，还须有启动子和 ____________ 等。启动子是 ________________________ 识别和结合的部位，有了它才能驱动目的基因转录出 mRNA ，最终表达出所需要的蛋白质。
(3)iPS 细胞和 iPGCs 细胞的形态、结构和功能不同的根本原因是 _____________ 。
(4) 该实验流程中用到的生物技术有 _____________ （答出 2 点即可）。
(1) 胰蛋白酶或胶原蛋白酶 血清
(2) PCR 技术（或人工合成法） 终止子、复制原点、标记基因 mRNA 聚合酶
(3) 基因的选择性表达
(4) 基因工程、动物细胞培养
【分析】胚胎干细胞 ( ES 细胞）具有自我更新及多向分化潜能，为发育学、遗传学、人类疾病的发病机理与替代治疗等研究提供非常宝贵的资源。 iPS 细胞技术是借助基因导入技术将某些特定因子基因导入动物或人的体细胞，以将其重编程或诱导为 ES 细胞样的细胞，即 iPS 细胞。
【详解】（ 1 ）动物细胞培养时，鸡胚组织剪碎后需用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，以获得单细胞悬液。动物细胞培养时一般需要在合成培养基中加血清等天然成分，以满足细胞对某些细胞因子的需求。
（ 2 ） OSNL 为目的基因，体外获取目的基因可通过 PCR 技术大量扩增或通过人工合成法来合成。基因表达载体中除目的基因外，还必须有启动子、终止子、复制原点和标记基因等。启动子是一段有特殊结构的 DNA 片段，位于基因的首端，它是 RNA 聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出 mRNA ，最终获得所需要的蛋白质。
（ 3 ）据图可知，由 iPS 细胞诱导形成 PGCs 细胞经过了细胞分化，该过程遗传物质没有改变，导致其细胞的形态结构和功能不同的根本原因是基因的选择性表达。
（ 4 ）由图可知，该实验流程中将 OSNL 基因导入鸡胚成纤维细胞利用了基因工程技术，诱导多能干细胞过程利用了动物细胞培养的技术。
番茄果实多呈扁球形，研究者从番茄突变体库中获得一长果形突变体 M ，并以其为材料对番茄果实形状的调控机制展开研究。
(1) 将突变体 M 与野生型的子房在 _____________ 水平进行性状比较（如图 1 ），可知细胞纵向伸长、横向变短导致突变体 M 子房及其发育而来的果实形态改变。
(2) 将突变体 M 与野生型番茄杂交， F 1 自交后代表现为 _____________ ，说明长果形是单基因隐性突变导致。将野生型和突变体 M 的候选基因扩增、测序，证实基因 M 为突变基因，图 2 为两种番茄 M 基因 cDNA （转录的非模板链）的部分测序结果。据图 2 ，可知突变体 M 的 M 基因发生 _______ ，造成蛋白质翻译在第 ____________ 位氨基酸后提前终止（终止密码子： UAA 、 UAG 、 UGA ）。
(3)M 基因编码棕榈酰胺转移酶 (M 酶 ) ，可催化蛋白 P 发生棕榈酰胺化修饰。敲除野生型番茄 P 基因获得果实变长的突变 P ，将人为突变的 P 基因（编码产物的棕榈酰胺化位点失活）在突变体 P 中超表达，结果如图 3 。为实现 P 基因的超表达，需要在 __________ 时选择合适的启动子，获得的转基因番茄还需检测其体内 _______ 。图 3 结果说明蛋白 P 对番茄果形的调控与 M 酶对蛋白 P 的棕榈化修饰无关，做出判断的依据是 _____________ 。
(4) 利用 _____________ 获得后代群体，并从中筛选出 M 基因与 P 基因的双突变体。比较发现双突变体与突变体 M 果形一致且长于突变体 P ，此结果 ____________ （支持 / 不支持）（ 3 ）结论，理由是 ____________ 。
(5) 进一步研究发现，蛋白 C 也会被 M 酶棕榈酰胺化修饰，修饰后的蛋白 C 会与蛋白 P 结合促进微管聚合，影响细胞形态。综合以上信息解释突变体 M 长果形成因： _____________ 。
(1) 器官和细胞
(2) 扁球形 : 长果形 ≈3:1 碱基对的缺失和替换 443
(3) 构建表达载体 是否有目的基因以及目的基因是否成功表达 转 P 基因和转突变 P 基因的突变体 P 均基本恢复正常果形
(4) 突变体 M 与突变体 P 杂交、自交 不支持 双突变体表型与突变体 M 表型一致，说明在无 M 酶的情况下，蛋白 P 无法影响番茄表型
(5) 基因 M 突变引起 M 酶失活，无法催化蛋白 C 棕榈酰胺化修饰，导致蛋白 C 不能与蛋白 P 结合，进而使细胞中微管无法聚合，子房细胞横向变短、纵向伸长，使果实发育成为长果
【分析】 DNA 分子中发生碱基对的替换、增添和缺失，而引起的基因结构改变。基因突变若发生在配子中，将遵循遗传规律传递给后代；若发生在体细胞中则不能遗传。
【详解】（ 1 ）图 1 中比较了野生型和突变体 M 的子房、子房纵切及子房细胞，是在器官和细胞水平上的比较。
（ 2 ）若长果形是单基因隐性突变，假设用字母 a 表示，则野生型的基因型是 AA ，突变体 M 的基因型是 aa ，突变体 M 与野生型番茄杂交， F1 的基因型是 Aa ， F1 自交后代的表现型及比例为扁球形 : 长果形 ≈3:1 。根据第 1320 位和 1321 位碱基可知突变体 M 发生基因突变的类型是碱基对的缺失和替换。 终止密码子为 UAA 、 UAG 、 UGA ，对应的模板链为 ATT 、 ATC 、 ACT ，则非模板链为 TAA 、 TAG 、 TGA ，三个连续碱基对应一个氨基酸，图中突变体 M 的 M 基因非模板链中 1330 ～ 1332 为 TAG ，模板链对应的为终止密码子，因此突变体 M 基因在 443 位氨基酸后提前终止。
（ 3 ）为实现目的基因的表达，需要构建基因表达载体，目的基因的检测需要检测宿主细胞中是否有目的基因以及目的基因是否成功表达。由图 3 的柱状图结果可知，转 P 基因和转突变 P 基因的突变体 P 均基本恢复正常果形，说明蛋白 P 对番茄果形的调控与 M 酶对蛋白 P 的棕榈化修饰无关。
（ 4 ）要将两种突变基因集合到同一个体上，则可将两种突变体进行杂交和自交，将突变体 M 与突变体 P 杂交、自交后发现后代双突变体与突变体 M 果形一致且长于突变体 P ，说明在无 M 酶的情况下，蛋白 P 无法影响番茄表型，这一结论与（ 3 ）结论不相符。
（ 5 ）综合第（ 3 ）、（ 4 ）问可知，再结合题干信息 “ 蛋白 C 也会被 M 酶棕榈酰胺化修饰，修饰后的蛋白 C 会与蛋白 P 结合促进微管聚合，影响细胞形态 ” 可知，基因 M 突变引起 M 酶失活，无法催化蛋白 C 棕榈酰胺化修饰，导致蛋白 C 不能与蛋白 P 结合，进而使细胞中微管无法聚合，子房细胞横向变短、纵向伸长，使果实发育成为长果。
高温胁迫会导致水稻严重减产。已知 D1 是光反应过程中的重要蛋白，为增强水稻应对高温胁迫的能力，科研人员将其叶绿体中编码 D1 蛋白的基因 psbA 转入水稻染色体 DNA 上，人为建立 D1 蛋白的补充途径，获得了产量显著提高的纯合 R 品系水稻。
(1) 光合色素通常与 D1 蛋白结合形成位于类囊体膜上的光合复合体 PSⅡ ，用于吸收、传递和转化 ________ 。
(2) 科研人员检测了野生型和 R 品系水稻在不同温度条件下 D1 蛋白的含量，结果如下图所示。
① 据图可知，高温胁迫会导致水稻细胞中 ________ ，而转入 psbA 基因可以 ________ 。
② 为证明 R 品系水稻细胞中表达的 D1 蛋白能正确定位到类囊体膜上，从 a ～ h 中选择字母填入下表横线处，补充实验设计。
a ．常温 b ．高温 c ．加入双缩脲试剂
d ．加入与 psbA mRNA 互补的小 RNA （用于干扰基因表达）
e ．加入胶体金标记的 D1 蛋白抗体
f ．紫色的深浅 g ． D1 蛋白的含量 h ．类囊体膜上胶体金的数量
| 组别 | 实验材料 | 温度条件 | 实验处理 | 检测指标 |
| 1 | 野生型水稻 | _______ | 加入胶体金标记的 D1 蛋白抗体 | _______ |
| 2 | R 品系水稻 | 高温 | _______ |
科研人员通过该实验证实了 D1 蛋白的定位正确，支持此结论的实验结果应为 ________ 。
(3) 请结合光合作用的原理推测高温胁迫下 R 品系水稻产量提升的原因。 ________ 。
(4) 从遗传育种角度分析，科研人员将 psbA 基因转入细胞核，而非叶绿体的优势是 ________ 。
(1) 光能
(2) D1 蛋白减少 增加 D1 蛋白的含量 b h
e R 品系水稻中类囊体膜上胶体金的数量显著高于野生型水稻
(3) 转入 psbA 基因后， D1 蛋白合成量增加，保证了光反应的正常进行
(4) 若将该基因转入叶绿体，则属于质基因，不能再亲子代间稳定遗传，转入细胞核则可以稳定遗传
【分析】由图可知，高温胁迫导致水稻细胞中 D1 蛋白减少，对比野生型和 R 品系可知，转入 psbA 基因增加 D1 蛋白的含量。高温胁迫主要影响 D1 蛋白的合成， D1 蛋白是光反应过程中的重要蛋白，从而影响光反应，所以 R 品系水稻产量提升是由于转入 psbA 基因后， D1 蛋白合成量增加，保证了光反应的正常进行。
【详解】（ 1 ）光合色素的功能是用于吸收、传递和转化光能。
（ 2 ） ① 由图可知，高温胁迫导致水稻细胞中 D1 蛋白减少，对比野生型和 R 品系可知，转入 psbA 基因增加 D1 蛋白的含量。
② 由表可知，该实验的自变量是是否转入 psbA 基因，因变量是类囊体上 D1 蛋白的含量，实验目的是证明 R 品系水稻细胞中表达的 D1 蛋白能正确定位到类囊体膜上，实验过程中应控制变量单一，故表中温度条件为 b 高温条件，实验处理为 e 加入胶体金标记的 D1 蛋白抗体，检测指标为 h 类囊体膜上胶体金的数量。若 R 品系水稻中类囊体膜上胶体金的数量显著高于野生型水稻，说明定位正确。
（ 3 ）由题意可知，高温胁迫主要影响 D1 蛋白的合成， D1 蛋白是光反应过程中的重要蛋白，从而影响光反应，所以 R 品系水稻产量提升是由于转入 psbA 基因后， D1 蛋白合成量增加，保证了光反应的正常进行。
（ 4 ）若将该基因转入叶绿体，则属于质基因，不能再亲子代间稳定遗传，转入细胞核则可以稳定遗传，所以科研人员将该基因转入细胞核。
重组 DNA 技术可以赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物类型和生物产品。该技术需要使用多种工具酶，下图所示为 5 种限制性内切核酸酶的识别序列和切割位点。回答下列问题。
(1) 在构建基因表达载体时，首先会用一定的限制酶切割 _______ ，使它出现一个切口；然后用同种限制酶或者能够产生相同末端的限制酶切割 _______ ；再利用 DNA 连接酶将两者拼接起来，这样就形成了一个重组 DNA 分子。
(2) 已知某种限制酶甲的识别序列和切点是 
。上述 5 种限制酶中，切割相应 DNA 后得到的黏性末端与限制酶甲切割后相同的是 _______ 酶。
(3) 常用的 DNA 连接酶有 E.coliDNA 连接酶和 T4DNA 连接酶。上图中 _______ 酶切割后的 DNA 片段可以用 E.coliDNA 连接酶连接。上图中 ____ 酶切割后的 DNA 片段只能用 T4DNA 连接酶连接。
(1) 载体 含有目的基因的 DNA 片段
(2)BamHⅠ
(3) SpeⅠ 、 XhoⅠ 、 BamH Ⅰ 、 XbaⅠ EcoR V
【分析】 E.coliDNA 连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链 DNA 片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而 T4 DNA 连接酶来源于 T4 噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端。
【详解】（ 1 ）在构建基因表达载体时，首先会用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的 DNA 片段；再利用 DNA 连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组 DNA 分子。
（ 2 ）限制酶甲切割后产生的黏性末端为 GATC—3' ，而 BamHⅠ 切割后产生的黏性末端也为 GATC—3' ，因此，切割相应 DNA 后得到的黏性末端与限制酶甲切割后相同的是 BamHⅠ 。
（ 3 ）限制酶 SpeⅠ 、 XhoⅠ 、 BamH Ⅰ 、 XbaⅠ 切割形成的是黏性末端，限制酶 EcoR V 切割形成的是平末端， E.coliDNA 连接酶只能将双链 DNA 片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而 T4 DNA 连接酶可用于连接黏性末端和平末端。 SpeⅠ 、 XhoⅠ 、 BamH Ⅰ 、 XbaⅠ 切割后的 DNA 片段（黏性末端）可以用 E . coli DNA 连接酶或 T4 连接酶连接，限制酶 EcoR V 切割后的 DNA 片段（平末端）只能用 T4 DNA 连接酶连接。
新冠病毒（ 2019nCoV ）入侵人体后引起新冠肺炎。 2019nCoV 有包膜，结构示意图如下图 1 ，其中 S 、 M 、 E 表示 3 种包膜糖蛋白， N 代表核衣壳蛋白；图 2 表示病毒侵染宿主细胞的增殖过程， RDRP 是 RNA 聚合酶。请据图分析回答问题：
(1) 新冠病毒糖蛋白 S 的基本组成单位是 ________ 。核衣壳蛋白 N 的合成场所是 ________ 。
(2) 由图 2 可知，新冠病毒 RNA 的功能有： ______________ 。 a.RNA 复制的模板 b. 转录的模板 c. 逆转录的模板 d. 翻译的模板 e. 病毒的组成成分抑制逆转录酶的药物 __________ （填 “ 能 ” 或 “ 不能 ” ）治疗该病，由此提出一种类似的治疗思路： ___________________________ 。
(3) 制备病毒灭活疫苗时，先大量培养表达 ______________ 的细胞，再接入新冠病毒扩大培养，灭活处理后制备疫苗。
(4) 以 RNA 为模板，通过 RT-PCR （反转录 - 聚合酶链式反应）技术可获取 S 蛋白基因。进行 RT-PCR 时一般需要加入 4 种脱氧核苷三磷酸（ dNTP ）而不是脱氧核苷酸，其原因是在子链延伸过程中 dNTP 提供 ___________ ，同时需加入的酶有： _________________ 。
(5) 据图 3 分析，要获取大量 S 蛋白基因应选择的引物是 ___________ 。通过电泳鉴定 PCR 的产物，结果如图 4 所示。 1 号泳道为标准（ Marker ，不同己知长度的 DNA 片段混合物）， 2 号泳道为阳性对照（提纯的 S 蛋白基因片段）， 3 号泳道为实验组。 3 号泳道出现了杂带，可能的原因有 ________________ 。
① 模板受到污染 ② 变性温度高 ③ 引物的特异性不强 ④ 退火温度偏低 ⑤ 退火温度偏高
(6) 若病毒 +RNA 分子用 32 P 标记，其中含碱基 A4000 个，碱基 U6000 个，宿主细胞含 31 P, 则产生 10 个含 31 P 的子代病毒，至少需要消耗宿主细胞 _________ 个游离的尿嘧啶核糖核苷酸。
(1) 氨基酸和葡萄糖 宿主细胞核糖体
(2) ade 不能 抑制 RDRP 的功能
(3) 能够表达 ACE2 受体
(4) 能量和原料 逆转录酶和耐高温的 DNA 聚合酶
(5) Ⅱ 、 Ⅲ ①③④
(6)64000
【分析】题图分析：图 1 中显示新型冠状病毒是一种 RNA 病毒，囊膜上含有多种蛋白。图 2 显示当病毒进入细胞后，利用 +RNA 合成相关的蛋白质，同时通过 ③④ 过程复制 RNA ，最后组装形成病毒，释放出细胞。
【详解】（ 1 ）新冠病毒糖蛋白 S 的基本组成单位是氨基酸和葡萄糖。核衣壳蛋白 N 的合成场所是宿主细胞核糖体。
（ 2 ）分析图 2 可知，新冠病毒 RNA 具有以下功能： RNA 复制的模板、翻译的模板、病毒的组成成分，故选 ade 。新冠病毒不是逆转录病毒，其 RNA 不具有逆转录功能；可以通过抑制 RDRP （ RNA 聚合酶）的功能来治疗该病。
（ 3 ）病毒表面的蛋白质可作为抗原激发机体的特异性免疫过程，制备新冠病毒灭活疫苗时，先大量培养能够表达 ACE2 受体的细胞，再接入新冠病毒扩大培养，经灭活处理后制备疫苗。
（ 4 ） dNTP 既能提供 PCR 需要的原料四种脱氧核苷酸，又能提供能量。以 RNA 为模板获得 DNA ，需要加入逆转录酶，在 DNA 大量扩增时还要有耐高温的 DNA 聚合酶（ Taq 酶）。
（ 5 ）引物要能与已知目的基因的一段序列结合， S 蛋白基因的磷酸基团是 5' 端，由于子链从 5' 端向 3' 端延伸，所以引物要与模板链的 3' 端结合，因此引物选择 Ⅱ 、 Ⅲ ，引物能使 Taq 酶从引物的 3' 端开始连接脱氧核苷酸。 3 号泳道为实验组，应该只出现与 2 号相同位置的条带，若电泳中出现杂带，原因可能是 ① 模板受到污染； ③ 引物的特异性不强； ④ 退火温度偏低等。
故选 ①③④ 。
（ 6 ）病毒 +RNA 分子用 32 P 标记，其中含有碱基 A4000 个，碱基 U6000 个，宿主细胞含 31 P ，则产生 10 个含 31 P 的子代病毒，首先需要合成 -RNA ，再以 -RNA 为模板合成 +RNA ，所以至少需消耗宿主细胞 4000+6000×10=64000 个游离的尿嘧啶核糖核苷酸。