4．在现代农业中，常在饲料中加入一定量的尿素来饲养牛等牲畜。因其有特殊的器官——瘤胃，在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物以尿素作为唯一氮源。某同学设计了如下实验，对能分解尿素的细菌进行分离和计数。

Ⅰ.取样：到屠宰场，在刚宰杀的牛的瘤胃中取样，将样品装入事先准备好的信封中密封。

Ⅱ.制备培养基：制备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数应明显多于选择培养基上的数目。由于初次实验，选择了一个较宽的稀释范围。并且每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。

Ⅲ.微生物的培养与观察：按稀释度的顺序分别吸取 0.1 mL进行平板涂布操作。将涂布好的培养皿放在30 ℃下培养，并且需要无氧条件。比较两种培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。挑选选择培养基上不同形态的菌落接入含酚红指示剂的培养基中，观察是否产生颜色反应。

Ⅳ.细菌的计数：当菌落数目稳定时，选取平板计数。

请回答下列问题：

(1)制备牛肉膏蛋白胨培养基的目的是什么？

(2)为什么每个稀释度下需要3个选择培养基？

(3)上述培养时，为什么需要无氧条件？

(4)含酚红的培养基应用的目的是什么？结果会呈现什么样的颜色反应？原理是什么？

(5)计数时应选什么样的平板进行计数？怎样计算出样品中的细菌数目？

答案

答案：(1)作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。

(2)每个稀释度下涂布3个平板，是作为重复组，以增强实验结果的说服力与准确性。

(3)由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气会受抑制甚至死亡。

(4)鉴别，看是否有分解尿素的细菌存在。如有该细菌存在结果会变红。原理是分解尿素的细菌产生脲酶，催化尿素分解产生NH₃，使培养基 pH升高，酚红指示剂呈红色。

(5)选择菌落数在30～300的平板进行计数。根据平板所对应的稀释度，对3个平板进行重复计数。然后求出平均值，以此估算样品中细菌的数目。

解析：本题是从反刍动物瘤胃中分离分解尿素的细菌的过程，是对利用选择培养基分离目的菌株基础知识的巩固，解题时注意以下问题：

(1)要设立基础培养基——牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，观察选择培养基是否具选择作用。

(2)要设立重复组，取平均值，如每一稀释度下涂布至少3个平板，以增强实验结果的说服力与准确性。

(3)瘤胃是一个缺氧环境，生活的微生物多为厌氧菌，分离时要注意创造无氧环境。

(4)进一步鉴别分解尿素的细菌需在培养基中加酚红指示剂，若此种菌存在，则会变红，原理是分解尿素的细菌能产生脲酶，催化反应：CO(NH₂)₂＋H₂OCO₂＋NH₃。因产生NH₃，使培养基碱性增强，pH升高，因此酚红指示剂呈现红色反应。

(5)为保证结果准确，计数应选择菌落数在30～300的平板。