如图所示为血红蛋白提取和分离的部分装置,回答下列问题。
(1)在进行样品处理时首先要对红细胞进行洗涤,目的是_______________。红细胞破碎后,通过_________________法将血红蛋白从混合液中分离出来,图甲所示为分离结果。若红细胞洗涤次数过少,则图甲结果可能会_____________。
(2)图乙装置可用于_________过程。现有一定量的血红蛋白溶液,进行上述操作时若要尽快达到理想的实验效果,可以_____________________(写出一种方法)。
(3)通过凝胶色谱法将样品进一步纯化,最后经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。凝胶色谱法是根据_________________分离蛋白质的方法。加人SDS可以使蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率完全取决于_________________。
去除杂蛋白(血浆蛋白),以利于后续步骤的分离纯化 低速短时间离心 分层不明显 透析(粗分离) 增加缓冲液的量(或及时更换缓冲液) 相对分子质量大小 分子的大小
【解析】
血红蛋白的提取和分离流程为:红细胞的洗涤→血红蛋白的释放→分离血红蛋白溶液→透析→凝胶色谱柱的制作→凝胶色谱柱的装填→样品的加入和洗脱。
【详解】
(1)洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白(血浆蛋白),以利于后续步骤的分离纯化。红细胞破碎后可以采用低速短时间离心的方法将血红蛋白从混合液中分离出来。若红细胞洗涤次数过少,血浆蛋白可能未被除净,导致离心分层时各种成分分层不明显。
(2)图乙装置可用于透析过程,若要尽快达到理想的实验效果,则可采用增加缓冲液的量或及时更换缓冲液的方法。
(3)①凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法。②加入SDS可以使蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率完全取决于分子的大小。
【点睛】
凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质的有效方法,相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程长,移动的速度慢,相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道,路程短,移动的速度快,因此相对分子质量不同的蛋白质得以分离。
过程 | 说明 | 图解 |
变性 | 当温度上升到90℃以上时,双链DNA解聚为单链 | |
复性 | 温度下降到50℃左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 | |
延伸 | 72℃左右时,TaqDNA聚合酶有最大活性,可使DNA新链由5'端向3'端延伸 |
细胞内DNA复制 | 体外DNA扩增(PCR) | ||
不同点 | 解旋 | 在解旋酶作用下边解旋边复制 | 80~100℃高温解旋,双链完全分开 |
酶 | DNA解旋酶、DNA聚合酶 | TaqDNA聚合酶 | |
引物 | RNA | DNA、RNA | |
温度 | 体内温和条件 | 高温 | |
相同点 | ①需提供DNA模板 ②四种脱氧核苷酸为原料 ③子链延伸的方向都是从5'端到3'端 |
项目 | 说明 | |
原理 | DNA在260nm的紫外线波段有一强烈吸收峰,峰值大小与DNA的含量是正相关 | |
过程 | 稀释 | 2μLPCR反应液,加入98μL蒸馏水,即将样品进行50倍稀释 |
对照调零 | 以蒸馏水作为空白对照,在波长260nm处,将紫外分光光度计的赌注调节至零 | |
测量 | 取DNA稀释液100μL至比色杯中,测定260nm处的光吸收值 | |
计算 | DNA含量(μg/mL)=50×(260nm的读数)×稀释倍数 |
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科研人员通过观察老年(65岁~79岁)14例、高龄(80岁~89岁)16例及长寿老人(≧90岁)12例,肝、脾组织基因组DNA含量的变化及差异,探讨衰老进程中DNA含量变化的规律,并为今后的衰老相关研究提供实验数据。实验的主要操作步骤如下:
一、称取组织100mg放入-80℃冰箱;
二、将组织放入1.5ml离心管中,同时加入样品裂解液,并用微量电动匀浆器充分匀浆;
三、加入蛋白酶,56℃消化48h,90℃高温蛋白质变性1h;
四、加入______酶和缓冲液,37℃水浴锅中放置1h,以去除样品中的RNA;
五、加入等体积的冷乙醇,离心取‚______;
六、缓冲液溶解DNA,进行DNA的含量和纯度检测。
实验结果如下表:
组 别 | 肝组织 | 脾组织 | ||
DNA 含量(mg/mL) | OD260/OD280 | DNA 含量(mg/mL) | OD260/OD280 | |
65~79岁 | 1.464 | 1.858 | 1.723 | 2.059 |
80~89岁 | 0.310 | 1.399 | 0.938 | 2.028 |
≧90岁 | 1.147 | 1.795 | 1.688 | 1.973 |
(注:表中OD260反映溶液中核酸的浓度,OD280反映溶液中蛋白质或氨基酸的浓度。理论上,纯DNA溶液的OD260/OD280为1.8。若比值大于1.8表示存在RNA残留,若小于1.8表示存在蛋白质污染)
请据表回答:
(1)推测第二步中样品裂解液的作用是______。
(2)补全实验步骤(______________);(______________)。
(3)与肝组织相比,从脾组织中提取的DNA中含有的______杂质更多,因此在提取脾组织中DNA时,上述实验流程可以怎样改进:______。
(4)无论肝组织还是脾组织中,高龄组DNA含量总比老年组少,说明在一定年龄范围内, DNA含量随着年龄的增长逐渐减少,说明DNA含量减少可能是______的分子基础。但长寿老人比高龄组的DNA含量显著增高,科学家推测可能长寿老人体内存在长寿基因,保持了对DNA______,减少了DNA的损伤,从而延缓了细胞的衰老。
(5)本研究可能存在一些不足,请指出其中的一项是______。