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使用次数:111
更新时间:2020-12-22
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1.

如图所示为血红蛋白提取和分离的部分装置,回答下列问题。

1)在进行样品处理时首先要对红细胞进行洗涤,目的是_______________。红细胞破碎后,通过_________________法将血红蛋白从混合液中分离出来,图甲所示为分离结果。若红细胞洗涤次数过少,则图甲结果可能会_____________

2)图乙装置可用于_________过程。现有一定量的血红蛋白溶液,进行上述操作时若要尽快达到理想的实验效果,可以_____________________(写出一种方法)。

3)通过凝胶色谱法将样品进一步纯化,最后经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。凝胶色谱法是根据_________________分离蛋白质的方法。加人SDS可以使蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率完全取决于_________________

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题型:综合题
知识点:DNA和蛋白质技术
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【答案】

去除杂蛋白(血浆蛋白),以利于后续步骤的分离纯化    低速短时间离心    分层不明显    透析(粗分离)    增加缓冲液的量(或及时更换缓冲液)    相对分子质量大小    分子的大小   

【解析】

血红蛋白的提取和分离流程为:红细胞的洗涤血红蛋白的释放分离血红蛋白溶液透析凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的装填样品的加入和洗脱。

【详解】

1)洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白(血浆蛋白),以利于后续步骤的分离纯化。红细胞破碎后可以采用低速短时间离心的方法将血红蛋白从混合液中分离出来。若红细胞洗涤次数过少,血浆蛋白可能未被除净,导致离心分层时各种成分分层不明显。

2)图乙装置可用于透析过程,若要尽快达到理想的实验效果,则可采用增加缓冲液的量或及时更换缓冲液的方法。

3凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法。加入SDS可以使蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率完全取决于分子的大小。

【点睛】

凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质的有效方法,相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程长,移动的速度慢,相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道,路程短,移动的速度快,因此相对分子质量不同的蛋白质得以分离。

=
考点梳理:
根据可圈可点权威老师分析,试题“ ”主要考查你对 多聚酶链式反应扩增DNA片段 等考点的理解。关于这些考点的“资料梳理”如下:
◎ 多聚酶链式反应扩增DNA片段的定义
多聚酶链式反应扩增DNA片段:

1、PCR原理:在解旋酶作用下,打开DNA双链,每条DNA单链作为母链,以4中游离脱氧核苷酸为原料,合成子链,在引物作用下,DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链,即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物,其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。
2、PCR反应过程是:变性→复性→延伸
过程 说明 图解
变性 当温度上升到90℃以上时,双链DNA解聚为单链
复性 温度下降到50℃左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸 72℃左右时,TaqDNA聚合酶有最大活性,可使DNA新链由5'端向3'端延伸

3、结果:上述三步反应完成后,一个DNA分子就变成了两个DNA分子,随着重复次数的增多,DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。

◎ 多聚酶链式反应扩增DNA片段的知识扩展
(1)PCR原理:在解旋酶作用下,打开DNA双链,每条DNA单链作为母链,以4中游离脱氧核苷酸为原料,合成子链,在引物作用下,DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链,即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物,其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。
(2)PCR反应过程是:变性→复性→延伸
在升温至90℃以上时DNA解旋;在降温至50℃左右时引物与DNA单链结合;在升温至72℃左右时合成DNA子链。
(3)DNA分子复制的人工控制
解开螺旋:在80~100℃时,DNA双螺旋打开,形成两条DNA单链,称为变性。
恢复螺旋:在50~60℃左右时,两条DNA单链重新形成双螺旋结构,称为复性。
复制条件:缓冲液,DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种引物。
控制仪器:PCR仪(温度周期性自动调节仪)。
(4)PCR的含义是多聚酶链式反应。
(5)PCR技术反应的条件:①稳定的缓冲溶液环境;②DNA模板;③合成引物;④四种脱氧核甘酸;⑤DNA聚合酶;⑥温控设备
(6)PCR技术最突出的优点是快速、高效、灵活、易于操作。
TaqDNA聚合酶的特点是:耐高温。
◎ 多聚酶链式反应扩增DNA片段的知识对比
细胞被DNA复制与PCR技术的比较:

细胞内DNA复制 体外DNA扩增(PCR)
不同点 解旋 在解旋酶作用下边解旋边复制 80~100℃高温解旋,双链完全分开
DNA解旋酶、DNA聚合酶 TaqDNA聚合酶
引物 RNA DNA、RNA
温度 体内温和条件 高温
相同点 ①需提供DNA模板
②四种脱氧核苷酸为原料
③子链延伸的方向都是从5'端到3'端
◎ 多聚酶链式反应扩增DNA片段的知识点拨
知识点拨:

1、DNA分子复制的人工控制
解开螺旋:在80~100℃时,DNA双螺旋打开,形成两条DNA单链,称为变性。
恢复螺旋:在50~60℃左右时,两条DNA单链重新形成双螺旋结构,称为复性。
复制条件:缓冲液,DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种引物。
控制仪器:PCR仪(温度周期性自动调节仪)。
2、PCR的含义是多聚酶链式反应。
3、PCR技术反应的条件:①稳定的缓冲溶液环境;②DNA模板;③合成引物;④四种脱氧核甘酸;⑤DNA聚合酶;⑥温控设备
4、PCR技术最突出的优点是快速、高效、灵活、易于操作。
5、TaqDNA聚合酶的特点是:耐高温。
◎ 多聚酶链式反应扩增DNA片段的知识拓展
知识拓展:

1、DNA含量的测定——分光光度法
项目 说明
原理 DNA在260nm的紫外线波段有一强烈吸收峰,峰值大小与DNA的含量是正相关
过程 稀释 2μLPCR反应液,加入98μL蒸馏水,即将样品进行50倍稀释
对照调零 以蒸馏水作为空白对照,在波长260nm处,将紫外分光光度计的赌注调节至零
测量 取DNA稀释液100μL至比色杯中,测定260nm处的光吸收值
计算 DNA含量(μg/mL)=50×(260nm的读数)×稀释倍数
2、DNA聚合酶不恩能够从头合成DNA,只能从DNA的3'端开始延伸DNA链,因此DNA复制需要引物。
◎ 多聚酶链式反应扩增DNA片段的教学目标
1、理解多聚酶链式反应扩增DNA片段的原理。
2、识记多聚酶链式反应扩增DNA片段的结果。
3、比较多聚酶链式反应扩增DNA片段 DNA复制的异同点。
◎ 多聚酶链式反应扩增DNA片段的考试要求
能力要求:了解/识记
课时要求:1
考试频率:易考
分值比重:0.5

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类题推荐:
DNA和蛋白质技术
难度:
使用次数:185
更新时间:2020-12-25
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1.

科研人员通过观察老年(65~79岁)14例、高龄(80~89岁)16例及长寿老人(90岁)12例,肝、脾组织基因组DNA含量的变化及差异,探讨衰老进程中DNA含量变化的规律,并为今后的衰老相关研究提供实验数据。实验的主要操作步骤如下:

一、称取组织100mg放入-80冰箱;

二、将组织放入1.5ml离心管中,同时加入样品裂解液,并用微量电动匀浆器充分匀浆;

三、加入蛋白酶,56消化48h90高温蛋白质变性1h

四、加入______酶和缓冲液,37水浴锅中放置1h,以去除样品中的RNA

五、加入等体积的冷乙醇,离心取______

六、缓冲液溶解DNA,进行DNA的含量和纯度检测。

实验结果如下表:

肝组织

脾组织

DNA 含量(mg/mL)

OD260/OD280

DNA 含量(mg/mL)

OD260/OD280

65~79

1.464

1.858

1.723

2.059

80~89

0.310

1.399

0.938

2.028

90

1.147

1.795

1.688

1.973

(注:表中OD260反映溶液中核酸的浓度,OD280反映溶液中蛋白质或氨基酸的浓度。理论上,纯DNA溶液的OD260/OD2801.8。若比值大于1.8表示存在RNA残留,若小于1.8表示存在蛋白质污染)

请据表回答:

1)推测第二步中样品裂解液的作用是______

2)补全实验步骤____________________________

3)与肝组织相比,从脾组织中提取的DNA中含有的______杂质更多,因此在提取脾组织中DNA时,上述实验流程可以怎样改进:______

4)无论肝组织还是脾组织中,高龄组DNA含量总比老年组少,说明在一定年龄范围内, DNA含量随着年龄的增长逐渐减少,说明DNA含量减少可能是______的分子基础。但长寿老人比高龄组的DNA含量显著增高,科学家推测可能长寿老人体内存在长寿基因,保持了对DNA______,减少了DNA的损伤,从而延缓了细胞的衰老。

5)本研究可能存在一些不足,请指出其中的一项是______

题型:实验题
知识点:DNA和蛋白质技术
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