PHB2 蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物 PHB2 蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称 phb2 基因），大小为 0 ． 9kb （ 1kb=1000 碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
（ 1 ）为获取 phb2 基因，提取该动物肝脏组织的总 RNA ，再经 __________ 过程得到 cDNA ，将其作为 PCR 反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
（ 2 ）图 1 为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使 phb2 基因（该基因序列不含图 1 中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的 phb2 基因两端分别引入 __________ 和 __________ 两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的 phb2 基因和载体进行连接时，可选用 __________ （填 “E ． coliDNA 连接酶 ” 或 “T 4 DNA 连接酶 ” ）。
相关限制酶的识别序列及切割位点
| 名称 | 识别序列及切割位点 | 名称 | 识别序列及切割位点 |
| HindⅢ | A↓AGCTT TTCGA↑A | EcoRI | G↓AATTC CTTAA↑G |
| PvitⅡ | CAG↓CTG GTC↑GAC | PstI | CTGC↓AG GA↑CGTC |
| KpnI | G↓GTACC CCATG↑G | BamHI | G↓GATCC CCTAG↑G |
注：箭头表示切割位点
（ 3 ）转化前需用 CaCl 2 处理大肠杆菌细胞，使其处于 __________ 的生理状态，以提高转化效率。
（ 4 ）将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为 1 、 2 、 3 、 4 ）培养并提取质粒，用（ 2 ）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图 2 ， ________ 号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
注： M 为指示分子大小的标准参照物；小于 0 ． 2kb 的 DNA 分子条带未出现在图中
（ 5 ）将纯化得到的 PHB2 蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养 24 小时后，检测处于细胞周期（示意图见图 3 ）不同时期的细胞数量，统计结果如图 4 。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的 __________ （填 “G 1 ” 或 “S” 或 “G 2 /M” ）期。
答案
（ 1 ）逆转录
（ 2 ） EcoRI PvitⅡ T 4 DNA 连接酶
（ 3 ）感受态
（ 4 ） 3
（ 5 ） G 2 /M
【分析】
分析图中质粒含有多个限制酶切位点，在启动子和终止子之间有三个酶切位点， KpnI 在质粒上有两个酶切位点， PvitⅡ 酶切后获得平末端。
图 4 中 G 1 期和 S 期细胞减少，而 G 2 期细胞数目明显增多。
将目的基因导入微生物细胞： Ca 2+ 处理法。
（ 1 ）
利用 RNA 获得 cDNA 的过程称为逆转录。
（ 2 ）
根据启动子和终止子的生理作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间．图中看出，两者之间存在于三种限制酶切点，但是由于 KpnI 在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择 EcoRI 和 PvitⅡ 两种不同限制酶的识别序列；根据 PvitⅡ 的酶切序列，切出了平末端，所以构建基因表达载体时，应该用 T 4 DNA 连接酶连接质粒和目的基因。
（ 3 ）
转化时用 CaCl 2 处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态的生理状态，以提高转化效率。
（ 4 ）
由于这些菌落都可以生长在含有氨苄青霉素的培养基中，因此都含有质粒，重组质粒包含了目的基因和质粒，如果用 EcoRI 和 PvitⅡ 两种酶切割重组质粒电泳后将获得含有质粒和目的基因两条条带，由于 phb2 基因大小为 0 ． 9kb ，所以对应电泳图是菌落 3 。
（ 5 ）
比较图 4 中 G 1 期和 S 期细胞减少，而 G 2 期细胞数目明显增多，说明了 G 1 期和 S 期细胞可以进入 G 2 期，而 G 2 期的细胞没有能够完成分裂进入 G 1 期，因此 PHB2 蛋白应该作用于 G 2 /M 期。
【点睛】
本题考察基因工程的知识，需要考生分析质粒的酶切位点，结合目的基因转入的位置进行分析，结合题干中目的基因的大小分析电泳图。
