某抗膜蛋白治疗性抗体药物研发过程中，需要表达 N 蛋白胞外段，制备相应的单克隆抗体，增加其对 N 蛋白胞外段特异性结合的能力。

Ⅰ ． N 蛋白胞外段抗原制备，流程如图 1

(1) 构建重组慢病毒质粒时，选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，目的是 ___________ 。用脂质体将重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞，质粒被包在脂质体 ___________ （填 “ 双分子层中 ” 或 “ 两层磷脂分子之间 ” ）。

(2) 质粒在包装细胞内组装出由 ___________ 组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化 N 蛋白胞外段。

Ⅱ ． N 蛋白胞外段单克隆抗体制备，流程如图 2

(3) 用 N 蛋白胞外段作为抗原对小鼠进行免疫后，取小鼠脾组织用 ___________ 酶处理，制成细胞悬液，置于含有混合气体的 ___________ 中培养，离心收集小鼠的 B 淋巴细胞，与骨髓瘤细胞进行融合。

(4) 用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到 96 孔板，进行 ___________ 培养。用 ___________ 技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生 N 蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集 ___________ ，提取单克隆抗体。

(5) 利用 N 蛋白胞外段抗体与药物结合，形成 ___________ ，实现特异性治疗。

答案

(1) 检测目的基因是否成功导入受体细胞     双分子层中

(2) 蛋白质外壳和含 N 蛋白胞外段基因的核酸

(3) 胰蛋白酶或胶原蛋白 CO ₂ 培养箱

(4) 克隆化     抗原抗体杂交     细胞培养液

(5) 抗体 - 药物偶联物 /ADC

【分析】 1 、单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的 B 淋巴细胞；诱导 B 细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。

2 、两次筛选： ① 筛选得到杂交瘤细胞（去掉未杂交的细胞以及自身融合的细胞）； ② 筛选出能够产生特异性抗体的细胞群。

3 、杂交瘤细胞的特点：既能大量增殖，又能产生特异性抗体。

【详解】（ 1 ）构建重组慢病毒质粒时，为检测目的基因是否成功导入受体细胞，常选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因。重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞需要依赖膜融合，故质粒被包在脂质体双分子层中（即磷脂双分子层）。

（ 2 ）由于目的基因为 N 蛋白胞外段基因，在包装细胞内组装出由蛋白质外壳和含有 N 蛋白胞外段基因的核酸组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化 N 蛋白胞外段。

（ 3 ）进行动物细胞培养时，需要取小鼠脾组织用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，制成细胞悬液，置于含有 95% 空气和 5% 的 CO ₂ 混合气体的 CO ₂ 培养箱中培养。

（ 4 ）用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到 96 孔板，进行克隆化培养和抗体检测。用抗原抗体杂交技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生 N 蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集细胞培养液，提取单克隆抗体。

（ 5 ）利用 N 蛋白胞外段抗体与药物结合，形成抗体 - 药物偶联物 ADC ，实现特异性治疗。